Обработанные сыворотки

Категория: Статьи. 23 Апрель 2013

Обработанные сыворотки

Хорошо окисленная сыворотка должна обладать гемолитической активностью в 3-6 раз большей, чем контрольная сыворотка в тех же разведениях. Оставшуюся необработанную сыворотку затем смешивают с оптимальным разведением йода и выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем диализуют против вороналового буфера при 4°С в течение ночи.

Обработанную йодом сыворотку затем смешивают с равным объемом 2М KSCN и инкубируют ночь при 4°С. Далее сыворотки диализуют в течение ночи при 4°С против вероналового буфера в объеме, превышающем объем сыворотки в 100 раз. Диализный мешок не следует наполнять больше, чем на 50%, чтобы обеспечить поступление воды. Наконец, сыворотку концентрируют, пропуская через фильтры РМ-10 или РМ-30 Amicon до исходного объема сыворотки (примерно в 5 раз), и замораживают пробы по 1 мл при -70° С.

Сыворотку, обработанную йодом - KSCN, необходимо проверить и установить степень окисления С2 путем определения гемолитической активности С2 и стабильности комплексов ЕАС 142. Для определения гемолитической активности к 0,2 мл ЕАС 14 (5хЮ8/мл в ЖВБ) прибавляют 0,2 мл I2 - KSCN обработанной сыворотки (можно попробовать разведения 1 : 100 и 1 :800) и инкубируют при 32 °С в течение 12 мин. Параллельно следует проверить такие же разведения необработанной сыворотки (контроль).

Далее 0,2 мл цельной человеческой сыворотки, разведенной в отношении 1 :2 0.2М ЭДТА, рН 7,2 (ЭДТА-сыворотка), добавляют в каждую пробирку и продолжают инкубацию при 32 °С 1 ч. Затем добавляют по 2 мл охлажденного во льду раствора и определяют гемолиз вышеописанным способом. ЕАС14, использующийся для теста с обработанной I2- KSCN сывороткой, должен содержать избыток С4. Приготавливают его таким же способом, как и при выявлении С4-зависимого розеткообразования (см. раздел Методы).

Перед использованием ЕАС 14 следует вновь добавить С1 так же, как это делается при приготовлении ЕАС140ху2 (см. Методы).


Полезные записи
Гетерогенность HLA-D-

Разделение клеток

Элюция клеток с колонки

Стеклянные бусы

Защита при хранении

Электрофоретическое фракционирование лимфоцитов

Обсуждение