Колонка из сефадекса

Категория: Статьи. 26 Февраль 2013

Колонка из сефадекса

Смесь переносят в пластмассовые пробирки и на 1-2 мин, подвергают действию ультразвука мощностью 50 Вт/см2, в результате чего происходит окончательное разделение суспензии. Концентрацию Р(аЬ)г-фрагментов доводят до 5- 15 мг/мл, проверку концентрации производят при коэффициенте пересчета 1,35 единиц оптической плотности на 1 мг и длине волны 280 нм. Растворы переносят в химические стаканы небольшого размера и осторожно перемешивают магнитной мешалкой в 0,1 М буфере карбоната-бикарбоната натрия. Во время перемешивания в смесь осторожно по каплям добавляют суспендированный тетраметилродаминизотио-цианат в расчете 0,03 мг флюорохрома на 1 мг F(ab)2-фрагмента.

Смесь оставляют перемешиваться на ночь при температуре 4° С в закрытом стакане.

Приготавливают колонку из сефадекса G-50 (3x25 см) в 0,01 М фосфатном буфере и колонку из ДЕАЕ-целлюлозы (1X7 см) с тем же буфером. Смесь для конъюгирования осторожно наслаивают на гранулы колонки и медленно элюиру-ют. Несвязавшаяся краска и соли буфера разделяются на колонке и выходят во втором пике после связавшихся белков.

На ДЕАЕ-целлюлозную колонку наносят проконъюгировав-шую смесь р(аЬ)2-родамин, вышедшую на предыдущей колонке первым пиком. Фракцию, проходящую через колонки без задержки, не собирают. Колонку элюируют приблизительно (30 мл) 0,05 М NaCl в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,5. После этого добавочно вносят по 30 мл растворов 0,126 М NaCl, 0,15 М NaCl и наконец 0,2 М NaCl все в 0,01 М фосфатном буфере. Конъюгат выходит обычно во фракции с концентрацией NaCl, равной 0,125 М. Считают, что эта фракция обладает оптимальными окрашивающими свойствами.

При необходимости для большей концентрации образца добавляют растворы в большем разведении, чем данные. При 280 нм и 515 нм определяют оптические плотности растворов. После этого образцы диализуют против раствора фосфатного буфера, содержащего 0,02% азида натрия.

При соотношении длин волн 280 к 515 нм желательно получить значения плотности такие низкие, как 1,5. F(ab)2-peareirrbi хранятся, как правило, при добавлении бычьего сывороточного альбумина в концентрации 20 мг/мл.


Полезные записи
Различные методы розеткообразования

Ингибиции иммунного связывания

MLC-типирование с помощью hla-d-гомозиготных клето...

Мышиные лимфоциты

Тесты, выявляющие рецепторы к вирусам

Характер тканевого распределения

Обсуждение