Ингибиции иммунного связывания

Категория: Статьи. 01 Март 2013

Ингибиции иммунного связывания

Очищенный С2 (0,3-1,0 мг/мл) окисляют непосредственно перед использованием. Окисление проводят путем добавления к С2 равного объема стандартного раствора йода (см. раздел Материалы, С2), разведенного в соотношении примерно 1:500 0,09 М фосфатным буфером, рН 6,0. Далее проводят инкубацию при комнатной температуре в течение 5 мин и немедленно охлаждают до 0°С. Нужное разведение раствора йода определяют путем обработки образцов С2 различной концентрацией йода, а затем определяют разведение, при котором наблюдается самое большое усиление активности С2.

Если хранение С2 осуществляется в буфере с ЭДТА, обладающем низкой ионной силой, и рН 6,0, соответствующее количество 5-кратного вероналового буфера и Са++ - Hg++ раствора следует добавить для достижения изотоничности и нейтрализации ЭДТА. Очищенные охуС2 или обработанную I2-KSCN сыворотку инкубируют с ЕАС 14 для достижения Ттах (см. последний раздел в Материалы, С2) при 32 °С и затем сразу же отмывают дважды охлажденным во льду ЖВБ. ЕАС114оху2 устойчивы в течение 1 нед при 0-2°С. Так как сыворотка, обработанная Ь-KSCN, может иногда содержать следовые количества С4, необходимо проверить ЕАС14оху2, полученные из такой сыворотки, и убедиться в том, что розетки с человеческими эритроцитами не образуются.

Если же ЕАС140Ху2 образуют розетки с человеческими эритроцитами, в дальнейшем следует использовать на 25-50% меньше сыворотки, обработанной I2-KSCN для приготовления ЕАС14°у2.

EACl-3d приготавливают из EACl-ЗЬ путем инкубирования с C4b-C3b INA в течение 1 ч при 37°С, а затем отмывают дважды холодным ЖВБ. Очищенный C4b-C3b INA необходимо протитровать на ингибицию иммунного связывания (29), используя ЕАС-ЗЬ, содержащий количество СЗЬ, равное тому, которое идет на выявление максимального количества CRL. EACl-ЗЬ нужно обработать восьмикратным количеством C4b-C3b INA, требующегося для 50% ингибиции иммунного связывания.

При использовании в качестве источника C4b-C3b INA модифицированной сыворотки очень важно освободить комплекс от С1. Для этого следует проинкубировать EACl-ЗЬ 90 мин при 37°С с 0,04 ЖВБЭ, затем отмыть один раз и ресуспендировать при концентрации 5Х108 в 1 мл в 0,04 ЖВБЭ.


Полезные записи
Иммуноглобулиновые колонки

Розетки с человеческими эритроцитами

Различные методы розеткообразования

MLC-типирование с помощью hla-d-гомозиготных клето...

Колонка из сефадекса

Мышиные лимфоциты

Обсуждение