Гемолитическая активность комплемента

Категория: Статьи. 19 Май 2013

Гемолитическая активность комплемента

Стандартный раствор йода следует хранить при 4°С в темной (коричневой) бутыли не больше недели. Количество использующегося йода может варьировать в зависимости от партий сыворотки; его можно определить при обработке небольших по объему образцов сыворотки различными разведениями стандартного раствора йода. Образцы сыворотки объемом по 1 мл смешивают с равными объемами стандартного раствора йода, разведенного в отношении As или Vis в 0,09 М фосфатном буфере, рН 6 и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин.

Сыворотку, обработанную йодом, диализуют в течение ночи при 4°С против 10 л вероналового буфера (ЖВБ, приготовленный без добавления желатины). Образцы сыворотки, обработанные йодом, сравнивают затем по способности увеличивать гемолитическую активность комплемента по сравнению с контрольной сывороткой, обработанной фосфатным буфером, рН б без йода. В пробирки объемом 5 мл, находящиеся во льду, наливают по 0,4 мл ЕА (5хЮ8/мл в ЖВБ) и по 0,4 мл разных разведений (в ЖВБ) сыворотки, обработанной йодом. Несколько различных разведений каждого образца йод-обработанной сыворотки и контрольной подвергают испытанию.

Обычно делают разведения 1:25, 1:50, 1:75 и 1:100. Далее ЕА и разведения сыворотки инкубируют при 37 °С в течение 1 ч, постоянно встряхивая пробирки, для поддержания ЕА в состоянии суспензии. Затем пробирки помещают в ледяную баню, добавляют по 2 мл охлажденного раствора и после центрифугирования определяют содержание гемоглобина в супернатантах, путем измерения оптической плотности при OD541. Для контроля, необходимого при измерении, готовят смесь: 0,4 мл ЕА инкубируют с 0,4 мл ЭВБ вместо сыворотки, а затем повторяют все остальные процедуры.

Определяют значение при OD541, эквивалентное 100% гемолизу при лизировании 0,4 мл образца ЕА с 2,4 мл воды. В результате этого теста определяют максимально возможное увеличение под действием комплемента гемолиза.


Полезные записи
Материалы, необходимые для окраски методика окраск...

Препаративное фракционирование активированных лимф...

Соединение HP с сефарозой

Селективные функциональные активаторы лимфоцитов ч...

Обсуждение