Гель-фильтрация смеси

Категория: Статьи. 05 Май 2013

Гель-фильтрация смеси

Данная процедура очистки основана на том факте, что кроличий IgG почти полностью распадается на р(аЬ)2-фрагменты, при этом фактически не остается Fab-фрагментов, ни целых молекул. Правильность этого факта должна быть проверена для условий каждой лаборатории путем проведения иммунологических анализов, способных выявить загрязнение 1-2% нераспавшихся IgG. Для удаления следовых количеств интактного IgG используют колонку, нагруженную белок-сефарозными бусами.

В случае использования сыворотки других животных (не кролика), например, барана или козла, после обработки пепсином будет образовываться меньшее количество F(ab)2-фрагментов. В этом случае необходимо фильтрование смеси через сефадекс G-150. Эту процедуру следует проводить и в том случае, когда объем кроличьей антисыворотки превышает 30 мл.

Если имеются большие количества антисыворотки, то во избежание потерь следует применять другой подход к решению вопроса.

Перед гель-фильтрацией смеси объем ее нужно уменьшить до 1Q мл и ниже. Это осуществляется путем добавления кристаллов сульфата аммония, как минимум до 50% насыщения раствора. После образования осадка смесь центрифугируют в течение 10 мин при 10 000 g. Осадок растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды и смесь наносят на колонку.

Собираемые с колонки Р(аЬ) фрагменты концентрируют таким же способом и диализуют против 0,1 М раствора. В случае использования антисыворотки барана или козла, выход Fab-фрагментов намного выше.

Конъюгирование с флюорохромом. Большинство ученых, предпочитают использование родамина, а не флюоресцеина с целью осуществления поверхностной окраски. Методы, используемые для осуществления конъюгации изотиоцианатов или флюоресцеина, совсем не различаются и представляют собой модификацию метода Amante с соавт.

С большой точностью взвешивают 5-10 мг тетраметилродамина-изотиоциа-ната и готовят суспензию, содержащую 1 мг вещества на 1 мл в 0,1 М буфере карбонат-бикарбоната натрия, рН 9,6.


Полезные записи
Иммунологическая лаборатория

Качество сравнительного значения

Лимфоциты, образующие спонтанные розетки

Характеристика лимфоцитов

Нормальные лимфоциты крови человека

Истощение розеток

Обсуждение