Два отмывания

Категория: Статьи. 15 Май 2013

Два отмывания

Можно провести их адсорбцию в среде, лишенной Са++ и Mg++, потери комплемента при этом почти не происходит. Небольшое загрязнение IgG антителами комплемента или IgM анти-ЭБ препарата, использующегося для образования ЕАС, можно не принимать во внимание, так как лимфоциты, имеющие рецепторы к комплементу, образуют ЕАС-розетки только через посредство СЗ рецепторов даже в присутствии IgG на ЕАС.

Один миллилитр 5% ЭБ инкубируют в течение 30 мин при 37° С с 1 мл выделенной фракцией IgM анти-Е сыворотки, внесенной в максимальной субагглютинирующей дозе; в результате этого образуются ЕА. После двух отмываний (при охлаждении) смешивают 1 объем 5% ЕА с равным объемом сыворотки кролика, дефицитной по С6, разведенной в отношении 1:2 или 1:4. После инкубации при 37° С в течение 30 мин и двух отмываний при охлаждении в конических центрифужных пробирках смесителя Vortex смешивают 0,5 мл 2% ЕАС с 0,5 мл лимфоцитов (16X106 в 1 мл, ТСМ в буферном растворе Хепес + 5% ЭТС или 0,4 HSA) и центрифугируют при 800 об/мин (100g) 5 мин.

Затем эту смесь инкубируют при 37 °С 15 мин и выдерживают минимум 15 мин в ледяной бане. Для того, чтобы избежать образования спонтанных розеток, пробирки инкубируют 5 мин при 37° и хорошо встряхивают в смесителе Vortex (образования спонтанных розеток можно избежать полностью путем использования ЕАС, образованных с человеческими или бычьими эритроцитами, вместо ЭБ ).

Смеси сливают вместе, концентрируют центрифугированием в круглодонных пробирках и суспендируют в 5 мл 8% HSA+1,7 мл 3% желатина. Розетки удаляют при очень коротком центрифугировании при 350g. ЕАС--клетки в супернатанте осторожно удаляют, не затрагивая осадок, и суспендируют в ТСМ с 5% ЭТС или 0,4% HSA для проведения К-клеточного теста или анализа поверхностных маркеров. ЕАС+-клетки, находящиеся в осадке, неактивны в К-клеточном тесте и после лизиса ЕАС с помощью NH4C1 не образуют вновь розеток.

Попыток оценить активность ЕАС+-клеток путем удаления связывающих мембран эритроцитов и комплемента не предпринималось.


Полезные записи
Количество молекул IgG на индикаторных эритроцитах...

Сыворотки крови человека

Тест на наличие SIg до и после обработки

Высвобождение фактора ингибиции миграции лейкоцито...

Вирус Эпштейна - Барра

Популяции НЭП

Обсуждение