Агрегированные человеческие Ig

Категория: Статьи. 29 Апрель 2013

Агрегированные человеческие Ig

В нашей лаборатории применен препарат агрегированных нагреванием иммуноглобулинов, обладающих многими свойствами комплексов антиген - антитело и способных связываться с теми же участками, с которыми связываются и комплексы антиген - антитело . Цель данной работы заключается в обсуждении полученных данных и в особенно внимательном рассмотрении технических аспектов данного метода, т. е. в его практическом применении.

Фракцию II человеческих Ig (Conn Fraction II, Miles Laboratories, 9 nc, Kankakee, III) растворяли в фосфатном буфере 0,05М Р04, 0.15М NaCl (PBS), рН 7,2. Добавляли 10% (объем/объем) карбо-натно-бикарбонатного буфера 0,5М рН 9,0. рН полученного раствора доводили до 9,0 при помощи ION NaOH. Конечная концентрация Ig была 50 мг/мл. Добавляли флюоресцеин изотиоцианат (FITC; Baltimore Biological Laboratories, Cockeysvill, md.), препарат перемешивали при 4°C 18 ч. Далее проводили истощающий диализ с PBS рН 7,2 для удаления непроконъюгировавших FITC.

Разные партии фракции II человеческих Ig (Cohn Fraction II) отличаются друг от друга по степени конъюгирования, достигаемой при определенных количествах FITC. В принципе препараты со степенью абсорбции (495/280 нм) между 0,5 и 1,0, полученные при концентрации 20-30 мг FITC на 1 мг белка, работают хорошо при последующей иммунофлюоресценции поверхности клеток, в то время как препараты со степенью абсорбции менее 0,4 не работают.

Агрегация достигается при нагревании до 62-63 °С в течение 20 мин. Препараты центрифугируют при 145 000 g в течение 1 ч и супернатант удаляют. Осадок (20-25% от исходного количества белка) гомогенизируется в PBS, рН 8,0 при концентрации, составляющей примерно 50 мг/мл в гомогенизаторе (Dounce homogenizer, Kontes Glass Co., Vine-land N. g.); рН доводится до 8,3 0,1N NaOH и агрегаты хранятся при 4°С до момента использования.

Замораживание и оттаивание, более низкие концентрации белка и более низкие показатели рН способствуют нерастворимости агрегатов и поэтому этих факторов следует избегать. Для использования препаратов необходимо довести их температуру до 23 °С, а концентрацию белка -до соответствующей величины, взятого при комнатной температуре.


Полезные записи
Лимфоциты различного происхождения

Подготовка колонок с гранулами, покрытыми иммунным...

Удаление моноцитов

Частички железа в суспензии

Селективная активность Т и В-клеточных митогенов

Ингибиция миграции индикаторных лейкоцитов суперна...

Обсуждение