Защита при хранении

Категория: Статьи. 22 Апрель 2013

Защита при хранении

Для данного теста розеткообразования можно использовать любой изотоничный буфер (PBS, ЖВБ, HBSS и т. д.). Азид натрия (0,03 М) можно использовать для защиты ЕАС; это вещество имеет и дополнительное преимущество- оно ингибирует Т-клеточиые розетки с эритроцитами барана (без азида натрия при 37 °С их количество незначительно) и кэппинг рецепторов (это очень ценно при постановке тестов по двойной метке для С-рецепторных розеток и иммунофлюоресценции поверхностных иммуноглобулинов). 2% бычий сывороточный альбумин (БСА) также способствует защите ЕАС при хранении и усиливает розетко-образование ЕАС с человеческими эритроцитами, уменьшая звездчатость эритроцитов. Непрерывное перемешивание в течение 5-20 мин при 37 °С на фотаторе (см. раздел Материалы) при 40 об/мин способствует установлению межклеточных контактов, которые приводят к образованию розеток. Инкубация клеток определенных лимфоидных линий с ЕАС 1-3d, превышающая 5 мин, может привести к слипанию розеток, что затруднит их подсчет.

При использовании нормальных CRL 20-минутная инкубация на вращающем устройстве вполне достаточна. Каплю из суспензии розеток покрывают сверху покровным стеклом, которое по краям приклеивают лаком и рассматривают под фазово-кон-трастным микроскопом (можно использовать фазово-контраст-ный гемоцитометр). Линзы объектива: 70-ЮОХмасляно-иммерсионные.

Если изучают лимфоциты, 200-300 клеток подсчитывают, определяют сколько из них является розетко-образующими клетками (3 или больше присоединившихся ЕАС); на основании этого определяют процент CR. В случае эритроцитов человека используют четырехклавишный счетчик и производят подсчет в поле разбросанных эритроцитов человека (200-300) по четырем следующим показателям: 1) не образующие розетки формы (0 или 1 присоединившиеся ЕАС); 2) розетки с 2 прикрепившимися ЕАС; 3) 3 прикрепленных ЕАС; 4) 4 прикрепленных ЕАС. Человеческие эритроциты с 4 прикрепившимися ЕАС встречаются очень редко. Вычисляют среднее количество связавшихся ЕАС на 100 человеческих эритроцитов, исходя из количества каждого типа розеток.

Этот метод подсчета розеток с человеческими эритроцитами обладает большей воспроизводимостью, чем подсчет процента розеток, но его нельзя применять для лимфоцитов, так как малые CRL могут содержать до 10 присоединившихся ЕАС.


Полезные записи
Элюция клеток с колонки

Обработанные сыворотки

Стеклянные бусы

Электрофоретическое фракционирование лимфоцитов

Обработка клеток нейраминидазой

Способность фракции

Обсуждение