Выделение и очистка IgG

Категория: Статьи. 16 Апрель 2013

Выделение и очистка IgG

Особое преимущество метода использования Р(аЬ)2-флюоресцирующих реагентов заключается в том, что иммунные комплексы, образующиеся после добавления этих реагентов к клеткам, имеющие следовые количества растворимых антигенов, таких, например, как сывороточный IgG, становятся неспособными к связыванию с Fc-рецепторами.

Антисыворотку смешивают с равным объемом насыщенного сульфата аммония и осадок центрифугируют 10 мин при 10 000 g. Супернатант отсасывается и отбрасывается. Осадок растворяют в минимальном объеме дистиллированной воды и диализуют против смен буфера, содержащего 0,05 М хлорида натрия, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5 (буферы готовят путем разведения стандартных растворов дистиллированной водой в нужных соотношениях). Раствор проходит через 1X15 колонку ДЕАЕ-цел-люлозы, уравновешенной тем же буфером.

Производят сбор фракции, проходящей в свободном объеме. Раствор диализуют против 0,1 М буфера ацетата натрия и после этого в нем определяют количество белка при 280 нм из расчета 1,35 единиц оптической плотности на 1 мг. Затем в раствор добавляют 1 мг пепсина на 100 мг IgG и смесь инкубируют при 37° С в течение 18 ч. Раствор нейтрализуют добавлением состава TrizmaR.

Очистка F (аЬ)2-фрагментов. В зависимости от имеющегося оборудования и количества антисыворотки следует применять ту или иную процедуру для разделения на составные части продуктов очистки. Простейшая процедура заключается в диализе смеси против 0,05 М NaCl 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5 и в пропускании смеси через 1x5 см колонку, наполненную гранулами ДЕАЕ-целлюлозы, уравновешенной этим же буфером. Производится сбор только свободно проходящей через колонку фракции. Ее диализуют против 0,1 М NaCl.

Если содержание белка в конечной смеси ниже 5 мг/мл, пробу необходимо сконцентрировать путем высаливания, как указано в следующем разделе.


Полезные записи
Поверхность градиента

Лимфоциты, которые собирают со дна пробирки

Сочетание разделения е-розеток и адсорбции на еа-м...

Стимулирующая способность

Однократное отмывание клеток

Тест примированных лимфоцитов (PLT)

Обсуждение