Стеклянные бусы

Категория: Статьи. 23 Апрель 2013

Стеклянные бусы

Стеклянные бусы (Superbrite тип 100-5005. 3 М Сотро-ny, St. Paul, Mo.

USA) заряжают отрицательно обработкой сильными кислотами (HC1 + HN03). После тщательного отмывания примерно 7 мл бус инкубируют с 1 мл HuF(ab)2 30 мг/мл. Смесь инкубируют 1 ч при 45° Сив течение ночи при 4° С. После трех отмываний фосфатным буфером, рН 7,2 (PBS), бусы, покрытые 120 мкг белка/мл бус (концентрация определена при проведении опытов с меченным 1251 материалом), помещают в шприц (объемом 10 мл) с калибровочной иглой № 22 для регулировки скорости тока (0,7 мл/мин).

На дно шприца помещают слой нейлоновой ваты для предотвращения попадания бус в иглу.

3 мл 2-фрагментов антител кролика (10 мг белка/мл, около 4 мг антител/мл), соответствующие объему колонки, вносят в колонку и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. После отмывания в PBS, а затем в ТСМ в буферном растворе Хепес с 5% ЭТС, 6-12x6 лимфоцитов в концентрации 4Х106 на 1 мл) вносят на колонку и сразу же элюи-руют той же средой, в объеме, превышающем в 4 раза объем колонки.

Иммунокомплексные колонки. Овальбумин (дважды кристаллизированный, лиофилизированный, Worthington, Biochem. Corp., Freehhold, N. J, USA) используется в качестве антигена на бусах. Антиовальбуминовую сыворотку кролика готовят путем 3-4-разовой внутримышечной инъекции 1 мг овальбумина в полном адъюванте Фрейнда. 15 мл стеклянных бус инкубируют с 2 мл овальбумина (25 мг/мл).

После отмывания бусы переносят в стеклянную колонку (15 мм в диаметре, на дне - слой нейлоновой ваты) и обрабатывают в течение 1 ч при комнатной температуре 6 мл инактивиро-ванной нагреванием антиовальбуминовой сыворотки разведенной: 1 объем+1 объем PBS. После отмывания 6-12ХЮ6 лимфоцитов их фракционируют на колонке, как описывается выше.

Выход лимфоцитов, прошедших через колонку, заряженных HuF(ab)2, овальбумином, ЭТС или HSA, обычно составляет 80-90% от нанесенного на колонку количества лимфоцитов; при этом соотношение основных субпопуляций лимфоцитов после фракционирования остается тем же, какое было до нанесения на колонку. Как показали эксперименты с белком, меченным 1251, элюции белка с колонки не происходит.


Полезные записи
Разделение клеток

Элюция клеток с колонки

Обработанные сыворотки

Защита при хранении

Электрофоретическое фракционирование лимфоцитов

Обработка клеток нейраминидазой

Обсуждение