Соединение HP с сефарозой

Категория: Статьи. 19 Май 2013

Соединение HP с сефарозой

Соединение HP с сефарозой производилось в стандартных условиях. 1 г высушенной при замораживании сефарозы растворяли и промывали на стеклянном фильтре 1 мМ НС1, затем 0,1 М NaHC03-0,5 М NaCl, рН 8,6. Затем гель (3-4 мл) конъюгировали с 3,4 мг HP, содержащим следовые количества 1251-меченного HP в 6 мл NaHC03- NeCl буфера при комнатной температуре в течение 2 ч. Смесь перемешивали медленными круговыми движениями. После этого гель тщательно отмывали связывающим буфером.

Оставшиеся активные группы блокировали путем инкубирования в течение 1 ч с 0,5 М раствором глицерина в 0,1 М NaHC03, рН 8,3. Для того, чтобы избавиться от избытка блокирующего агента и физически адсорбированного HP, гель промывали попеременно буферными растворами с высокой и низкой рН (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,0 и 0,1 боратный буфер, рН 8,0; оба буфера содержали 0,5 М NaCl). Перед использованием НР-сефарозный гель промывался PBS и стоял (уравновешивался) в течение ночи с PBS, содержащим 0,2% HSA и 0,02% NaN3.

При этих условиях с каждым граммом сефарозного геля (3-4 мл) связывалось по 2,5-3 мг HP. Оказалось, что эти 3-4 мл HP сефарозного геля способны задержать все НР-связывающие клетки, имеющиеся в 80 100x106 обработанных нейраминидазой лимфоцитов. Более низкие количества замещенного НР-сефарозного геля недостаточны, чтобы осуществить полную задержку HP-связывающих клеток, в то время как большая степень замещения затрудняет элюцию клеток в нужных концентрациях с конкурентного гаптена .

Фракционирование клеток. НР-сефарозным гелем (3- 4 мл) заполняли небольшую колонку (0,9X15 см, К 9/15 Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Швеция), снабженную 85 мкм нейлоновой сеткой (Nytal Seidengazefabrik A. G. Thai, Швейцария). В колонку вносилось 80-=-100Х6 лимфоцитов, обработанных нейраминидазой в 1 - 1,5 мл PBS, содержащем 0,2% HSA и 0,02% NeN3. Клеточная суспензия инкубировалась на геле в течение 15 мин при комнатной температуре.

Клетки, не задержавшиеся на колонке, смывались 80 мл PBS-HSA-NaN3 при скорости протекания жидкости 6- 10 мл/мин.


Полезные записи
Материалы, необходимые для окраски методика окраск...

Гемолитическая активность комплемента

Препаративное фракционирование активированных лимф...

Селективные функциональные активаторы лимфоцитов ч...

Дополнительные элементы

Метод культивирования и постановка теста

Обсуждение