Подготовка колонок для удаления с них lg-положительных клеток

Категория: Статьи. 11 Май 2013

Подготовка колонок для удаления с них lg-положительных клеток

С сывороткой большинства видов млекопитающих процедура преципитации сульфатом аммония дает раствор с концентрацией иммуноглобулинов после возврата к исходному объему сыворотки.

Во время мечения гранул концентрация Ig в жидкости должна быть как минимум 1 мг/мл. После покрытия гранул они переносятся в подходящие колонки (или же остаются в той же колонке, где происходило мечение). В большинстве экспериментов применялись колонки Pharmacia 1,5X30 см, но можно использовать и другие типы колонок.

Колонки промываются по крайней мере тройным объемом физиологического раствора и инкубируются вновь, на сей раз с анти-Ig сывороткой, и метятся в течение 60 мин при температуре 4° С или при комнатной температуре. Мы использовали поливалентную анти-Ig сыворотку, направленную против тяжелых цепей большинства классов Ig, а также против легких цепей. Количество анти-Ig антител в сыворотке обычно достигало концентрации 1 мг/мл (во время мечения в колонке сыворотку использовали в разведении 1:3).

Существует простои тест, позволяющий определить содержание анти-Ig антител в анти-Ig сыворотке. Он заключается в использовании небольших преципитацпонных пробирок, в которые добавляются равные объемы антисыворотки и сверху осторожно доливается изотонический солевой раствор требуемых молекул IgG в концентрации 1 мг/мл. Должна произойти ясно выраженная преципитация между двумя реагентами в течение 1-2 мин.

Для данного теста подходит любой вид животного, так как у всех животных имеются одинаково пригодные для данного теста анти-Ig антитела. В нашей лаборатории использовалась апти-Ig сыворотка барана или кролика.

Колонки с гранулами, меченными антигенами или анти-Ig антителами и затем промытые, не должны переноситься из холода в тепло (из 4°С в 20°С), так как образование пузырьков воздуха может серьезно помешать последующему прохождению клеток через колонку. Разделение на колонке должно производиться при температуре 4° С, если существует возможность потери клетками аффинитета при температуре 37° С или при комнатной температуре.


Полезные записи
Популяции НЭП

Стандартные растворы

Инкубация очищенной популяции

C4b-C3b инактиватор  (C4b-C3b INA)

Фильтрование через нейлоновую вату

Функциональная характеристика розеткообразующих кл...

Обсуждение